自然界中广泛存在的各种传染性病菌可引发多种重大疾病，极大地威胁着人类的健康，近年来又出现了所谓高耐药性的超级细菌，其主要原因也是新型高性能抗生素的研发速度赶不上病原菌的变异速度。其中，革兰氏阴性菌是临床常见的病原菌，其特殊的外膜成分是产生高致病性和高耐药性的关键。β-桶状蛋白 (Outer membrane proteins, OMPs) 是细菌外膜的主要蛋白成分，新生肽链在胞内合成后被运送到外膜，并由外膜β-桶蛋白整合机器(β-barrel assembly machinery，BAM) 帮助折叠成桶型结构并整合到外膜中。前期研究揭示了BAM整合底物的初始阶段，而有关 BAM 如何完成底物β-桶的折叠、关闭及释放的分子机制尚不清楚。

2023年4月26日，77779193永利|主頁欢迎您!生命科学学院周如鸿教授团队及合作者在Nature上发表题为“Structural basis of BAM-mediated outer membrane β-barrel protein assembly”的研究论文，首次捕捉到了BAM与底物β-桶蛋白EspP在外膜折叠整合过程中的多个中间态构象，同时通过体内外功能分析及全原子分子动力学模拟揭示了底物OMP的组装、关闭及释放的全过程，为以此蛋白复合物为靶点的新型抗菌药物研发提供重要科学依据。

首先，团队通过在BAM与EspP预测的互作区域引入不同位置的半胱氨酸使其在体内自发形成双硫键的策略成功获得BAM-EspP 复合体蛋白，并通过单颗粒冷冻电镜技术和分子动力学模拟首次解析了双桶打开（open state）、预关闭（ready-to-close state）、半关闭（semi-closed state）和全关闭（full-closed state）状态的高分辨率三维结构，展示出 BAM在组装底物 OMP的完整动态变化过程，阐明了BAM对于 EspP的识别、整合及释放的工作机制（图1）。

图1. BAM-EspP 的四个动态中间态冷冻电镜密度图与动态结构图

研究发现，BAM 的各结构域构象变化参与了诱发底物整合过程中各阶段的启动。起始阶段，BamA β-桶N端的β1链向外打开，作为模板帮助EspP肽链折叠整合，形成β-片层。在预备闭合和半闭合构象中，BamA桶状结构从外开 (outward open) 状态转变为内开 (inward open) 至内关 (inward closed) 状态，通过结合细胞膜张力对相连的底物β-片层施加内卷动力，使其向内弯卷成桶状结构，并在β1与β12之间形成氢键关闭β-桶，同时BamA β-桶的N端与底物剥离。底物β桶结构的折叠与释放依赖于OMPβ1与β12的氢键，而胞内端的氢键则帮助BamA-β1识别底物，启动折叠。BAM辅助亚基BamB-E与BamA的周质附件（POTRAs）在胞内形成周质环，顺时针旋转，部分POTRA域的连接环随构象改变与BamA-β桶或辅助亚基产生不同相互作用。基于此，研究人员提出BAM“旋转和闭合”机制。

BamA属于OMP85蛋白超家族，参与多种外膜蛋白的组装，在进化上对β-桶组装功能是保守的。该研究为靶向耐药菌干预提供了启发，并加深了对真核细胞双膜细胞器线粒体和叶绿体中β-桶蛋白的保守折叠与整合机制的理解。

该工作与77779193永利|主頁欢迎您!医学院张兴教授团队、四川大学华西医学院董浩浩研究员团队合作完成，77779193永利|主頁欢迎您!生命科学院博士后陈骏为该论文的共同第一作者，77779193永利|主頁欢迎您!周如鸿教授为共同通讯作者，77779193永利|主頁欢迎您!生命科学学院博士生谢腾参与了本工作。该研究得到了国家重点研发计划，国家自然科学基金，国家生物药技术创新中心，国家自主创新示范区上海张江重大项目，77779193永利|主頁欢迎您!上海高等研究院繁星基金等资助。

原文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-023-05988-8

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